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中药材中多真菌毒素检测方法摘要

更新时间:2023-11-20      点击次数:867

来自《2351 真菌毒素测定法-2020版药典》

本法适用于药材、饮片及中药制剂中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、展青霉素、伏马毒素B1、B2及T-2毒素的测定。

 

1、 仪器分析方法:

1-1  HPLC法(液相色谱法),采用柱后衍生法,碘衍生法光化学衍生法,测试黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮4类

1-2  LC-MS/MS法(液相色谱-串联质谱法),测试全部种类及多种真菌毒素同时分析

1-3  ELISA法(酶联免疫法),仅测试黄曲霉毒素类

 

2、 前处理方法

 

2-1前处理方法(适用于HPLC法和LC-MS/MS法)

 

举例(测试黄曲霉毒素):取供试品粉末约15g(过二号筛),精密称定,置于均质瓶中,加入氯化钠3g,精密加入70%甲醇溶液75ml,高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11 000r/min),离心5分钟(离心速度4000r/min),精密量取上清液15ml,置50ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,离心10分钟(离心速度4000r/min),精密量取上清液20ml,通过免疫亲合柱,流速每分钟3ml,用水20ml洗脱(必要时可以先用淋洗缓冲液10ml洗脱,再用水10ml洗脱),弃去洗脱液,使空气进入柱子,将水挤出柱子,再用适量甲醇洗脱,收集洗脱液,置2ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.22μm)滤过,取续滤液,即得。

 

前处理方法中,一是称样量多达15-20g,有些中药材比较珍贵,成本较高;

二是采用免疫亲和法进行前处理,操作步骤复杂,柱子储运使用条件需要保持低温。

三是每种真菌毒素对应一种免疫亲和柱和一种仪器分析条件,测试多种真菌毒素时,成本很高,而且效率较低。

一般基于这三种原因,实验员查找其他的前处理方法。

 

2-2 前处理方法(适用于ELISA法)

 

称取供试品粉末2.0g50ml离心管中,加入20ml甲醇,振荡5分钟,室温(20~25℃)下以每分钟3000转离心5分钟,取2ml上清液至10ml干净离心管中,于50~60℃水浴氮气流下吹干,加入2ml去离子水涡动30秒,再加入6ml三LV甲烷振荡2分钟,室温下以每分钟3000转离心5分钟,取下层三LV甲烷液3ml至10ml离心管中,置氮吹仪上于50~60℃水浴浓缩至干,加入1ml正己烷涡旋30秒,再加入2ml磷酸盐缓冲液涡旋1分钟,室温下以每分钟3000转离心5分钟,取下层液,即得。

 

前处理方法中,两次浓缩转溶操作,容易影响结果平行性,氮吹浓缩的效率相对低。

 

2-3前处理方法(适用于展青霉素,LC-MS/MS分析)

 

供试品溶液的制备  取供试品粉末约4g(过二号筛),精密称定,置于均质瓶中,加水20ml和果胶酶(活性大于1500IU/g)75μl,混匀,40℃下放置2小时,精密加入乙腈60ml,高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11 000r/min),离心10分钟(离心速度4000r/min),取上清液20ml,加入无水硫酸镁-无水醋酸钠(4:1)混合粉末3g,充分振摇2分钟,离心10分钟(离心速度4000r/min),取上清液8ml,通过展青霉素固相净化柱,收集净化液,混匀,精密量取5ml(相当于0.3g样品),置玻璃试管中,40℃条件下用氮气吹至近干,加2%乙腈溶液(用乙酸调节pH值至2)定容至0.5ml,涡旋2分钟使混匀,用微孔滤膜(0.22μm)滤过,取续滤液,即得。

 

前处理方法中加入酶,并且在40℃下放置了2小时,采用展青霉素专用固相萃取柱做前处理,此方法只做展青霉素,比其他采用免疫亲和柱净化的前处理方法略微简化。

 

2-4 前处理方法(适用于10种真菌毒素,LC-MSMS分析)

 

测定药材、饮片及中药制剂中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、B2及T-2毒素。

 

取供试品粉末约5g(过二号筛),精密称定,精密加入70%甲醇溶液50ml,超声处理30分钟,离心,精密量取上清液10ml,用水稀释至20ml,摇匀。精密量取3ml,缓慢通过已经处理好的HLB柱[规格:3ml(60mg),依次用甲醇和水各3ml洗脱],直至有适量空气通过,收集洗脱液;随后用3ml甲醇洗脱,收集洗脱液,合并两次洗脱液,于40℃氮气缓慢吹至近干,加50%乙腈溶液定容至1ml,用微孔滤膜(0.22μm)滤过,取续滤液,即得。

 

前处理方法中采用了多功能固相萃取柱,经过活化平衡淋洗洗脱步骤后,上机到LC-MSMS分析,“方法六适用于样品中多种真菌毒素的筛查测定,实际操作中如果遇到毒素有检出,但样品中监测离子对峰面积比与对照品的监测离子对峰面积比不一致时,建议选用其他监测离子对重新进样确证或选用其他检测方法进行判定"

 

3、 小结

 

3-1 酶联免疫法(ELIS法)仅测试黄曲霉毒素类,其他的真菌毒素不在其中;

3-2 HPLC法测试4类,每类真菌毒素对应一种前处理方法和仪器分析方法;

3-3 LC-MS/MS法可以单独测试某种真菌毒素,也可以一次进样检测多种真菌毒素,分析结果用于筛查还是定量分析,取决于方法验证的数据是否符合定量分析的要求。

3-4 LC-MS/MS法的前处理方法引入了固相萃取法净化,一次前处理操作、一次进针分析10种真菌毒素,这为提高效率、节约时间人力物力成本指明了优化方向。

3-5 基于LC-MS/MS法,FaTEx-gen固相萃取柱不用活化平衡、淋洗洗脱,样品萃取溶液一步通过SPE柱后,填料保留杂质,即得目标物上机分析

 

4、 FaTEx-gen多真菌毒素一步法净化柱操作步骤(10多种真菌毒素)

称取2g样品,添加一定体积的酸化乙腈溶液,震荡30min,离心10分钟,取一定体积的上清液加入FaTEx-gen,以每秒1滴的速度流出,氮吹转溶后上机到LC-MS/MS分析。

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